活性测定：采用FDA活体染色法

茉莉花是茉莉木犀科素馨属香花植物,可用于茉莉花茶的窨制和香料提取。双瓣茉莉是花原我国茉莉花栽培的主要品种,其花冠筒分为两轮,花瓣洁白,产量高,花香浓,是窨制茉莉花茶的主要原料,具有重要的经济价值；植株抗逆性较强,易于栽培,也是用于研究的理想材料。获得可稳定遗传的生质时表转基因植株虽然是研究植物基因功能的重要手段,但由于耗时长、成本高、体瞬转化体系不成熟等因素仍限制着当今许多植物品种的达体分子生物学研究。瞬时表达技术结合报告基因的建立及使用为研究目标基因功能提供了快速、高效的茉莉途径,拟南芥、烟草、花原番茄、生质时表玉米原生质体细胞,体瞬烟草叶肉细胞,烟草BY-2细胞以及洋葱表皮细胞等介导的基因瞬时表达体系已被广泛应用于目标蛋白表达、亚细胞定位、达体启动子及蛋白活性检测、建立及蛋白互作等基因功能研究分析。茉莉现阶段植物细胞的花原瞬时转化研究主要集中在模式植物,在花卉植物上的研究相对较少。然而,生质时表异源受体细胞对同一蛋白的表达效果可能存在差异,为了使目标基因的表达产物正确折叠,修饰并精准定位于相应的亚细胞结构,选择同源植物细胞瞬时表达分析可增加研究的准确性。

前人在茉莉花品种形态特征、香气特性和精油提取方面做了大量研究,但关于功能基因在细胞水平方面的研究甚少,而关于茉莉花原生质体瞬时表达的方法还未见报道,因此建立茉莉花原生质体制备和转化体系为深入开展茉莉花细胞水平及分子水平的功能基因组研究具有重要意义。本研究通过酶解法分离到大量有活力的双瓣茉莉花花瓣原生质体,运用PEG介导的瞬时转化体系,成功鉴定了3个茉莉花来源的目标蛋白在原细胞中的亚细胞定位,为高通量开展茉莉花候选基因的功能分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

茉莉花供试材料为自然条件下盆栽种植的双瓣茉莉,取自福建农林大学茉莉花种质资源圃。拟南芥供试材料为哥伦比亚生态型,由本实验室人工气候室培育,生长条件为22℃,光照13h(22℃),黑暗11h,光照强度约80μmol·m^-2·s^-1,湿度60％。拟南芥种子在4℃冷室春化48h后,移至温室萌发,萌发后的种子移至蛭石上,定期浇灌1/4hoAG1AnD营养液。

1.1.2 质粒载体

试验所用载体P35s-GFP来源于细胞表达载体P2FGW7(6666BP),表达框由花椰菜花叶病毒(CAmＶ)35s启动子、绿色荧光蛋白(GFP)基因和胭脂碱合成酶终止子(nos)构成。质粒在大肠杆菌dh5α菌株中扩增后,大量提取纯化质粒dnA,电泳鉴定并测定质粒dnA浓度和纯度,D260nm/d280nm＝1.8～1.9,DnA浓度为1μG·μ1^-1,-20℃保存备用。

Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP载体：Js1hY、JssWEET1和JssWEET17是福建农林大学园艺学院伍炳华课题组从茉莉花花朵CDnA中利用RACE引物分离克隆到的3个基因,其中Js1hY属于mYB转录因子家族的生物钟1hY/CCA1的同源编码基因；JssWEET1和JssWEET17属于糖转运蛋白sWEET家族的两个编码基因。3个基因均已亚克隆至细胞表达载体P2GWF7(6670BP)的GFP编码序列的阅读框5'端,构建了Js1hY-GFP、JssWEET1-GFP和JssWEET17-GFP载体。

1.1.3 试剂

主要试剂有纤维素酶(CE11ｕ1AsE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、离析酶(mACERoZYmE‘onoZｕKA’R10,YAKｕ1TPhARmACEｕTiCA1inDｕsTRY)、果胶酶(PECTinAsE,siGmA)、牛血清白蛋白(BsA,siGmA)、mEs(siGmA)、PEG4000(siGmA)、二乙酸荧光素(F1ｕoREsCEindiACETATE,FDA,siGmA)、碘化丙啶(PRoPiDiｕmioDiDE,Pi,siGmA)。其余基本试剂均购自生工生物公司。

1.2 外植体材料的处理

参照YooETA1的方法,选取生长5～6周的拟南芥真叶中完全伸展的叶片,或自然盆栽下3年生茉莉花植株的嫩叶,用单面刀片将叶片切成宽约0.5～1.0mm的细丝,与酶液充分混合后,进行原生质体分离。

本试验还选用盛开的茉莉花花瓣作为分离原生质体的酶解材料,并借鉴YooETA1、WｕETA1和ZhEnGETA1的方法,采用不同的处理方式,本文命名为切丝法、胶撕法和磨砂法,比较对茉莉花花瓣原生质体分离效率的影响。选取3～5朵新鲜开放的花朵0.1～0.4G,采用不同的处理方式使花瓣细胞暴露：A切丝法,用刀片将花瓣切成宽度为0.5～1.0mm细条；B胶撕法,用胶带纸粘住花瓣正反面,轻轻撕去粘在下表皮上的胶带,使花瓣细胞暴露；C磨砂法,用极细石英砂轻轻摩擦花瓣下表皮,造成表皮轻微磨损暴露出花瓣细胞。处理后的花瓣组织立即移至酶液中,进行原生质体分离,每个处理试验设置3个生物学重复,分别统计花瓣原生质体产量和活性。

1.3 原生质体的分离方法

叶片或花瓣原生质体的制备方法参照YooETA1的方法,并略做修改,将处理后的植物材料浸泡于含15G·1^-1纤维素酶和4G·1^-1离析酶的酶解液中,酶溶剂为20mmol·1^-1KC1,0.4mol·1^-1甘露醇,20mmol·1^-1mEsPh5.7,10mmol·1^-1CAC12和1G·1^-1BsA的混合液,抽真空处理30min后,在25℃黑暗条件下静置酶解4h,之后置于水平振荡器上以200R·min^-1的转速震荡10min,使原生质体充分释放到酶解液中。向酶解混合液中加入等体积的W5溶液(154mmol·1^-1nAC1,125mmol·1^-1CAC12,5mmol·1^-1KC1,2mmol·1^-1mEsPh5.7),经200目纱布过滤后,于200G,4℃离心3min,弃上清收集原生质体,之后再加入2m1的W5,静置冰上40min,移除上清后,加入2m1W5溶液重悬,测定原生质体总量。

为优化茉莉花瓣原生质体的分离效率,将切丝法处理后的花瓣组织置于含一定浓度梯度纤维素酶或果胶酶的酶解液中,黑暗条件下酶解3～6h,在显微镜下统计原生质体产量和死亡率,确定适宜的酶液组合和酶解时间,试验重复3次。使用荧光染料Pi检测原生质体的死亡率。向100μ1收集的原生质体中加入1μ1Pi溶液(100μG·m1^-1)混匀,取10μ1至载玻片上,在荧光显微镜下统计一个视野中发出红色荧光信号的原生质体个数和白光视野下原生质体的总个数,观察视野5～10个,原生质体死亡率/％＝(发红色荧光的细胞数/原生质体总数)×100。

1.4 原生质体的产量与活性测定

产量测定：通过血球计数板计数。收集的原生质体重悬于W5溶液中,取少量滴于0.1mm血球计数板上,在光学显微镜下观察,选取膜结构完整的原生质体计数,每个样品计数3个重复,取平均值,统计原生质体产量。悬浮液中原生质体浓度/(个·m1^-1)＝血球计数板平均每个大方格(0.1mm3,即0.1μ1)的原生质体个数×104。原生质体产量,即每克鲜重材料所得的原生质体个数/(个·G^-1)＝原生质体的浓度(个·m1^-1)×悬浮原生质体的W5溶液体积(m1)/花瓣质量(G)。

活性测定：采用FDA活体染色法。每100μ1悬浮的原生质体中加入1μ1FDA染色液(5mG·m1^-1溶解于丙酮),取10μ1置于载玻片上,在荧光显微镜下检查其活性,活力高的原生质体在荧光下显微镜下可发出黄绿色荧光。

1.5 原生质体的瞬时转化

将沉淀后的原生质体用mmG溶液(0.4mol·1^-1甘露醇,15mmol·1-1mGC12,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重悬,使其浓度达到2×105个·m1^-1,用于PEG介导的遗传转化。每100μ1原生质体样品与10μ1外源质粒dnA(1μG·μ1^-1)以及110μ1PEG溶液[400G·1^-1PEG4000,0.2mol·1^-1甘露醇,0.1mol·1^-1CAC12]充分混匀后,室温静置5min,加入440μ1W5溶液终止反应,200G离心弃上清.用100μ1W1溶液(0.5mol·1^-1甘露醇,20mmol·1^-1KC1,4mmol·1^-1mEsPh5.7)重悬原生质体,22℃黑暗条件下培养12～16h,可观察原生质体转化效率或目标蛋白的亚细胞定位。

为改善茉莉花瓣原生质体的转化效率,将分离纯化后的花瓣原生质体重悬成不同浓度的细胞液,向转化体系中加入不同量的P35s-GFP质粒dnA,与等体积的不同质量浓度的PEG溶液轻柔混匀,使转化体系的PEG终浓度分别为50、100、150、200和250G·1-1,室温静置分别处理2、5、10、15和30min,转化后的原生质体暗处孵育16h,在显微镜下统计转化效率,试验重复3次.转化效率检测:向100μ1转化后的原生质体加入1μ1Pi溶液,取10μ1至载玻片上,在荧光显微镜下统计1个视野中发出红色荧光信号的原生质体个数,表达绿色荧光蛋白的原生质体个数和白光视野下原生质体的总个数,观察视野5～10个,原生质体转化效率/％＝[发绿色荧光的原生质体数/(原生质体总数-Pi染色发红色荧光的细胞数)]×100。

1.6 共聚焦显微镜观察细胞定位

含目标基因的瞬时表达载体转入原生质体,孵育16h后,从管底吸取10μ1原生质体溶液置于载玻片上,用1EiCATCssP8激光共聚焦显微镜观察目标蛋白表达情况。用于观察GFP信号的荧光激发光波长为488nm,发射波长为505～535nm；观察叶绿体自发荧光的激发光波长为633nm,发射波长为647～685nm。

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